酶底物法快速检测水中菌落总数结果准确性考究

　　菌落总数(Totalcoliforms)是判定水质被细菌污染程度的重要指标之一，其测定方法也有一定的标准。平皿计数法是早期传统的水中菌落总数标准检测方法，其应用研究也比较多，如钱冬梅应用平皿计数法测定了生活饮用水中的菌落总数。这种方法实验步骤较为繁琐，对操作人员的专业水平要求比较高，不适用于应急快速检测，无法对水的卫生状况做出快速评价。

　　酶底物法是近些年来新兴的水中菌落总数检测方法，操作简便，结果易判断，适用于快速检测。但不少用户对此种方法存疑，不知道这种方法出来的检测结果是否科学准确，下面优尔普就以平皿计数法的检测结果为准，用酶底物法程控定量封口机进行实验检测对比。

立科酶底物法程控定量封口机

酶底物法快速检测水中菌落总数实验

一、实验操作部分

1、实验原理

　　酶底物法使用的复合酶技术培养基包含多种独特的酶物质，每种酶物质都针对不同的细菌酶设计(包含普遍的水介传播细菌)，所有的酶底物被分解时均产生相同的信号。在检测菌落总数时，这个信号显示为365纳米紫外4O城镇供水NO.22013灯下的荧光。

2、材料与试剂

　　立科定量盘、lmL移液管或移液枪、10mL移液管或移液枪、培养箱(35±1)、6瓦366FIITI紫外灯、紫外灯箱(23cmx30onx17on1)、无菌水。

3、方法步骤

酶底物法检测方法操作步骤

(1)首先向100mL装有固体培养基的瓶中加入无菌水至刻度，摇匀，制成液体培养基，然后放置在冰箱中保存，使用有效期为5天。见图1。

(2)取1mL水样及9mL液体培养基倒入立科定量盘中。见图2。

(3)将定量盘盖好，在水平桌面上旋动将所有水样分配到定量盘的孔中(孔中的气泡不会影响结果)。见图3。

(4)将定量盘竖起呈垂直90度，将多余的水样由盘内海绵吸收。见图4。

(5)将定量盘缓慢翻转过来，于培养箱中(35±0.5)培养48h(若结果为可疑阳性则延长培养时间至72h)。见图5。

(6)计数：培养完成后将培养盘盖打开，用紫外灯在定量盘上方13on处照射，数显荧光的孔数。对照MPN表得出结果。注意：海绵条显荧光不必记录在读数范围内。由于本方法的最大检测上限为738MPN/mL，如需稀释时，将结果乘以稀释倍数即为报告读数(如稀释l0倍时的操作为：加入0.1mL样品和9.9mL液体培养基)。

二、结果与分析

1、盲样比对实验--T检验分析

　　选取三个水质检测实验室对比同一盲样(标准试剂)进行酶底物法和平皿计数法比对试验，具体试验结果如图。

EPA标准盲样检测结果

　　对比以上酶底物法和平皿计数法检出共160个结果进行配对T检验，两种方法的配对T检验结果如下表。

配对检验结果

　　标配比变量差值的T检验结果，Mean均值之间的差值为-1.78750，Std.Deviation差值的标准差16.10385，Std.ErrorMean差值的调准误为1.80047，95%ConfidenceIntervaloftheDifference置信区间上下限为-5.37124和1.79624，t-valuet值为-0.993，df自由度为79，Sig(2-tailed)双尾T检验的结果，获得t值的概率P值为0.324，检验结果表明酶底物法和平皿计数法检测结果没有统计学意义上的差别(P<0.50)。

2、水样检测--线性回归分析

　　采集地表水水样进行检测，为保证实验结果的有效性和方便统计，要求检测高、低浓度两个水样，同时，要求低浓度水样的MPN值控制在50MPN/ml左右，高浓度水样的MPN值控制在100MPN/ml左右，分别从国内9个地区采集水样，试验结果如图。

实验室水样检测结果

　　对以上9家实验室用酶底物法和平皿计数法共1160个检测结果进行线性回归统计分析，两种方法线性回归分析见下表。

检测结果线性回归统计分析

　　从图表中可知，标准化回归系数Beta为0.95，表明两组数据相关性较好，两种方法的检测结果具有可比性。检验结果P=0.00，均小于0.05，表明两种方法在检测菌落总数时没有显著差异性，具有等效性。此结果说明酶底物法的测定结果准确、可靠，可以替代平皿技术发作为水中菌落总数的测定方法。

　　从上述实验可以看出，酶底物法快速检测水中菌落总数的检测结果与平皿计数法无统计学意义上的差别，是科学的、有效的、准确的，可以用作评价水质微生物污染的标准依据。酶底物法操作简单，结果判读容易、准确，无需稀释即可检测738个/1mL水样，不仅适用于水源水、饮用水的检测，还适用于应急检测和污水检测，易于推广，可以较好的弥补传统方法的不足。